电针干预放射性脑损伤小鼠海马区突触可塑性相 - 数理化学习杂志社投稿

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电针干预放射性脑损伤小鼠海马区突触可塑性相

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摘要：

0 引言 Introduction

放射疗法在控制疾病的进程中有重要意义，但放射线治疗引发的脑部损伤也不容忽视[1]。放射性脑损伤是放疗引发的并发症之一，严重危害人类的健康，可降低患者生活质量[2]。放射性脑损伤的严重程度与放射剂量呈正相关[3] Gy的X射线辐射可对Long-Evans大鼠学习记忆能力产生影响[4]，课题组前期研究同样发现8 Gy以上放射剂量即可造成C57BL/6J小鼠出现认知功能损伤[5]。动物实验发现电针干预可改善阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆功能，但其具体机制尚不明了[6]。此外，Notch信号通路对神经干细胞增殖具有调控作用，并且Notch信号通路与海马突触可塑性以及学习记忆密切相关[7-8]。因此，该研究采用电针干预放射性脑损伤小鼠“百会”“风府”及双侧“肾俞”穴，观察电针对放射性脑损伤小鼠学习记忆的影响，检测海马区Notch通路相关蛋白及突触可塑性相关蛋白表达变化，探讨电针对放射性脑损伤的保护作用机制。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2019年4至6月在河南中医药大学动物实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 30只SPF级30 d龄C57BL/6J雄性小鼠，体质量10-13 g，购于北京维通利华生物科技有限公司，许可证号为SCXK(京)2016-0006，实验单位许可证号为SYXK(豫)2015-0005。将实验动物随机分为空白组、模型组和电针组，每组10只。该实验已通过河南中医药大学伦理委员会批准(动物伦理审查批准编号为DWLL)。将小鼠置于7：00- 19：00光照和19：00 -7：00黑暗的实验室，水食不限，室温20-25 ℃，湿度为50%-60%。

1.3.2 实验用主要仪器与试剂一次性针灸针(苏州医疗用品厂0.30 mm×13 mm)；电子针灸治疗仪(无锡佳健医疗器械股份有限公司，型号G6805)；全自动Morris水迷宫设备(淮北正华生物仪器设备有限公司，型号SC-b5)；体视学显微镜(Leica，型号M205FA)；直线加速器(Varian Clinac 600 CD，Radiation Oncology Systems，SanDiego，CA，USA)；石蜡切片机(Leica，型号2235)；LAS1000 CCD曝光检测系统(Fujifilm，Tokyo，Japan)；抗 BrdU 单克隆抗体 (Abcam，ab895)；BrdU(Servicebio，B8010)；兔抗单克隆Notch1抗体(Abcam，ab)；兔抗单克隆Hes1抗体(Servicebio，GB)；突触素兔抗鼠多克隆抗体(武汉三鹰，-1-AP)；脑源性神经营养因子兔抗鼠多克隆抗体(Servicebio，GB)；突触后致密蛋白95兔抗鼠多克隆抗体(Servicebio，GB)。

1.4 实验方法

1.4.1 放射性脑损伤模型制备[4，9]将模型组与电针组C57BL/6J小鼠进行造模。腹腔注射2%戊巴比妥钠(0.01 mL/g)麻醉，将小鼠俯卧置于放射平台进行X射线照射，照射剂量为单次8 Gy，射线源距离脑99.5 cm，剂量率为400 cGy/min，照射过程持续约10 min。脑组织接受剂量的变异约±5%，造模结束后次日每组10只小鼠进行T迷宫及水迷宫行为学测试进行模型评估，测试后每组随机筛选6只小鼠进行后续的电针干预等操作。

1.4.2 电针干预方法用小鼠固定器将小鼠俯卧位固定于操作台上，取穴方法参考《实验针灸学》[10]。电针穴位取百会(顶骨正中)、风府(枕骨顶嵴后枕寰关节背凹陷处)及肾俞(第2腰椎后两旁凹陷处)。回路1取百会和风府，回路2取双侧肾俞。用一次性无菌针灸针刺入深度约为1 mm，连接电针仪设置电压1.5 V，频率10 Hz，波宽1 ms，针刺时间为20 min/次，1次/d，连续针刺21 d。每日电针干预后各组小鼠以0.01 mL/g腹腔注射5 g/L胸腺嘧啶衍生物BrdU。模型组和空白组不进行电针干预，但模拟抓取与固定。电针干预结束后次日开始行为学测试。

1.4.3 T迷宫实验在迷宫两臂碗里放入食物，将小鼠放入T迷宫适应2 d，训练时将T迷宫的左臂闸门打开，右臂关闭，小鼠只能进入右臂获取食物，15 s后撤去所有闸门，两臂全部打开后将小鼠放入开始臂中，若小鼠选择未曾进入的臂为正确选择，反之为错误选择。每只动物每天进行4次训练，每次间隔15 min，连续4 d。随后进行测试，记录每组小鼠的错误次数。

1.4.4 水迷宫实验 T迷宫实验结束后进行水迷宫测试，圆形水池直径为120 cm，高40 cm，水池内放一直径10 cm，高25 cm的圆形平台，将圆形水池任意等距离的分为(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)4个象限，并将圆形平台置于其中1个象限。开始往水池注水，水深约30 cm，水温控制约25 ℃，水面高于平台约1 cm，然后倒入脱脂奶粉使水不透明。系统跟踪分析软件自动记录游泳路线。定位航行实验为前6 d，记录其逃避潜伏期，第7天撤去平台，记录其穿越平台次数和目的象限停留时间。

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